Le film s'articule autour des deux personnages qui lui donnent son titre, les frères Blues, gangsters flegmatiques et sympathiques, reconnaissables à leurs Ray-Ban Wayfarer, à leurs costumes et chapeaux noirs, à leurs montres et à la discordance de leur carrure respective. Ils se retrouvent lorsque « Joliet » Jake (incarcéré pour vol à main armée) est libéré de la « Prison Joliet » 1 sous la responsabilité de son frère Elwood. Ils apprennent que l'orphelinat où ils ont été élevés va être rasé, à moins de payer les arriérés de taxes foncières dans les plus brefs délais. Ils ont 11 jours pour ramener l'argent à la mère supérieure, "la pingouine". Les aventures commencent, et, dès le début, leur conduite insouciante (dans une vieille voiture de police Dodge Monaco 1974, affectueusement connue en tant que Bluesmobile), attire l'attention de la police. Les Blues Brothers passent donc le reste du film à chercher les membres de leur groupe désormais dissous, pour les convaincre de les rejoindre à nouveau. Ils souhaitent remonter sur scène afin de récolter honnêtement la somme de 5 000 $ nécessaire à la survie de l'orphelinat. Leur trajet est ponctué de péripéties, où prennent place des numéros musicaux à la fois spontanés et organisés, hommages au Rhythm and blues noir américain. Comédie musicale, le film, truffé de scènes d'action, implique de talentueuses légendes qui reprennent des standards de la musique populaire américaine. Le duo se fait de nombreux ennemis, notamment un groupe néonazi, un brave tenancier, une fine équipe de chanteurs country racistes et visiblement pro-NRA, la police de Chicago, très vite secondée par celle de tout l'État de l'Illinois, auxquelles s'ajoutent les forces d'interventions spéciales, l'armée et jusque l'ancienne fiancée de Jake, rendue démente par son abandon et qui tente de l'assassiner de nombreuses manières... Il en résulte plusieurs courses poursuites en voiture et une énorme quantité d'accidents : plus de soixante véhicules de police sont détruits et treize Bluesmobiles sont nécessaires pour les scènes de carambolage. Jusqu'à la sortie de G.I. Joe en 2009, le film détenait d'ailleurs le record du plus grand nombre de véhicules détruits (parodiant la course poursuite du film French Connection) et de destructions diverses (dont une grande surface désaffectée, reprenant du service à l'occasion du tournage).